整合式过程分析技术、建模和控制策略的最新进展，赋能单克隆抗体连续生产
本文节选自《Recent advances in integrated process analytical techniques, modeling, and control strategies to enable continuous biomanufacturing of monoclonal antibodies》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
美国食品和药物管理局(FDA)早在1982年就批准了第一个重组生产的胰岛素生物药产品 (或称生物制品)，这为使用生命系统的复杂生物分子药物生产开辟了新的道路。从那时起，包括单克隆抗体(mAb)在内的一系列生物药已被批准用于治疗各种自身免疫性疾病、癌症和遗传性疾病。生物药也被证明对治疗细菌和病毒感染有效。例如，一些mAb(如Biocon的Itolizumab)正在进行治疗SARS-CoV-2病毒感染的临床试验。mAb之所以成为众多疾病治疗的热门选择，通常在于其特异性和安全性。此外，用于上游生产和下游纯化工艺的成熟平台技术的可用性也使基于蛋白质的生物药的大规模生产成为可能。然而，生产质量稳定、成本低廉的生物药仍然是一项挑战。因此，通过实施创新的制造策略，如其它行业正在采用的整合式入线/在线/近线过程监测、建模和控制，以提高产品质量并优化生物药生产工艺至关重要。FDA发布了在制药工业中使用过程分析技术(PAT)的关键指南。PAT系统，也称为过程监控和分析系统，在生产中的应用，为连续工艺/产品改进铺平了道路，其通过强化的过程监测、基于知识的数据分析、质量源于设计(QdD)概念的集成以及实时反馈控制，实现这一目标。图1概述了工艺建模、PAT和控制系统是如何协同工作，以满足连续mAb生产线的工业和法规要求的。
图1. 基于mAb的连续生物制药生产线以及先进PAT、建模和过程控制策略如何使mAb生产达到所需的质量和产量的示意图。
在过去的十年中，连续生产(CM)模式获得了大量的关注，因为它在基于小分子药物的药物生产中已被证明具有显著的好处，而现在，它正被评估用于生物药的生产。然而，生物药生产中连续生产原则的实施并不简单，因此，目前还没有看到行业范围内的快速商业化应用。最近使用连续生产技术的进展大多局限于单个单元操作，且仅有限地集成到整个工艺流中。目前，还没有通过“端到端”的连续生物工艺生产的商业化产品；然而，学术界和产业界已经报道了一些合作研究案例。特别是，2021年的整合式连续生物制造指南为生物制药公司和合同制造商提出了实施策略，并为供应商的设备设计提供了路线图。总的来说，行业采用连续生产进度缓慢的主要原因在于上游的连续部分没有通过PAT和控制策略发挥其最大潜力，而下游的连续设备和传感技术还没有完全成熟。此外，当前的工业思维是以批次为导向的，而即使是简单的批次设置，许多公司也无法达到监管标准。因此，在采用相对更为复杂的连续工艺，以用于商业化应用方案时，存在很大的犹豫。此外，为了实现可靠的“端到端”连续工艺，除了常规PAT工具外，还需要在整个连续生产线上策略性地设置可靠的预测工具。例如，由于上游工艺的动态特性，在连续的上游操作后，决定是否将样品上样到层析柱是一个挑战。这要求对培养基中的mAb浓度进行更快的分析(在几分钟甚至几秒钟内)，从而为下游操作做出更快的决策。一些作者报道了使用在线高效液相色谱(HPLC)或近红外(NIR)光谱进行实时决策的案例研究。然而，在大多数情况下，还是需要从培养液中离线提取样品以进行检测，而不是针对灌流生物反应器进行入线/近线检测。连续生产中另一个重要的工艺任务是单元操作之间缓冲罐的可实施控制。在连续的一系列工艺步骤中，缓冲罐是关键的中间步骤，起着重要的作用。缓冲罐的控制需要使用分层控制策略，以确保控制的稳健性。由于连续工艺涉及一系列反应动力学和原理各异的步骤，单靠PAT和/或控制并不能保证过程中控制的稳健性。因此，必须使用基于混合建模和数据分析的工具，利用实时数据和从以前的设计空间结果中获得的经验来做出迅速的决策。亦即，需要有明确的动力，开发一个明确的科学、技术和监管框架，以便使行业在未来更广泛地采用连续生物生产。
在本文中，我们将总结介绍在生物药(如mAb)中实施连续生产的进展和障碍。我们将强调连续生物生产中与PAT、建模和过程中控制策略整合相关的关键问题。最后，我们将讨论未来的方向以及利用近年来已被其它各个行业成功采用的连续生产策略。
生物药连续生产的目前状态
典型的生物生产过程包括上游细胞培养步骤，其中，含有目的基因的重组细胞系用于生产所需的生物产品，然后是一系列下游纯化步骤。为了最大限度地提高工艺产量和工艺经济效益，人们现在越来越重视使用连续工艺取代传统的批次单元操作。下文将简要讨论最近的技术创新，这些技术创新使mAb生产方式的转变成为可能。
上游细胞培养步骤
与下游单元操作相比，连续上游细胞培养现在已相对成熟。已有20多种商业化生物药使用基于灌流生物反应器的技术生产。细胞截留设备，如交替式切向流(ATF)，不仅可用于灌流(以实现高细胞密度)，而且可用于细胞培养液的初步澄清。表1总结了设备和PAT技术的最新发展，其帮助实现了上游操作从批次向连续的过渡。ATF可以按各种方式使用(如在N-1灌流种子培养阶段)，以实现高密度种子工艺、浓缩补料分批操作或可提供各种优势的连续灌流操作。例如，如果产物是稳定的，较长的操作时间对生产来说不是问题，那么就可以使用浓缩补料分批。如果产品是稳定的，但生产阶段没有可整合大规模灌流技术的设备，那么可以选择高密度工艺并在N-1阶段实施灌流，以降低连续操作的规模。如果产物在培养基中不稳定(如激素)，则灌流可能是首选方法。理由是，在灌流过程中，可以保持稳态，而且据报道，随着时间的推移，其可有助于获得一致的产品质量。然而，工艺整合仍然是一个主要的挑战，因为连续操作需要与生物生产的其它几个阶段兼容，以满足监管要求。例如，在实施灌流技术时，与下游捕获步骤的整合仍有不小的挑战性，因为很难在不同单元操作的不同最佳质量流速之间建立平衡。为了解决这个问题，可以引入缓冲罐，在那里，ATF滤出液可以暂存一小段时间；但是，需了解缓冲罐暂存时间对产品质量的影响，以支持此类操作。另一个障碍是由于时间和资源的限制，连续灌流操作的工艺优化有限。为此，行业迫切需要开发可规模缩小的设备和相关的工艺模型，以更好地探索灌流技术的设计空间，并与下游步骤进行更有效的整合。
表1. 使连续生物生产成为可能的技术和发展。表中突出显示了最近在典型mAb生产工艺的不同方面所取得的进展，以及整合这些解决方案、以实现用于连续生物生产的端到端解决方案的工作。
表2. 与最终药物产品相关的关键质量属性和实时PAT实施示例，以支持连续的生物生产。
下游纯化步骤
细胞培养生产的生物产物通常需要经过多个步骤的纯化以及表征。例如，一个典型的mAb产品需要经过2-3个批次模式蛋白质层析步骤的处理，例如：在产物制剂之前，需进行初步的捕获步骤(如ProA亲和层析)以及1到2个离子交换或多模式层析精纯步骤。除此之外，还有一些中间性蛋白质浓缩和缓冲液置换步骤以及病毒灭活和基于过滤的操作。总的来说，这些不同的单元操作使得建立真正整合的连续工艺极具挑战性。为此目的，行业已经取得了一些重要的进展，参见表1。正在研究的两种主要选择包括周期性逆流层析(PCC)和模拟移动床层析(SMB)。然而，这些工艺通常涉及多根分离柱，要求所有层析操作精确协调，并对所需的蛋白质馏分收集做出及时决策。因此，需要快速优化下游方案，以实时响应上游操作对中间产物质量属性的影响。 最后，行业迫切需要开发可规模缩小的设备(具有集成软件和PAT)，使其能够更有效地与基于连续、微量规模的灌流系统进行整合，从而更高效、更经济地探索下游蛋白质纯化/浓缩设计空间。
工艺分析
自2004年以来，美国食品和药品管理局(FDA)和其它监管机构一直主张在原料药/药物产品生产中增加过程分析技术(PAT)和质量源于设计(QbD)的使用。可见，密切监控关键工艺参数(CPP)和关键物料属性(CMA)，以防止可能影响最终产品关键质量属性(CQA，如mAb糖基化、电荷或聚体状态)的偏差非常重要；在应对失败模式时，实时地纳入过程中的控制措施也很重要。这使得在过去20年中逐步开发的监测工具取得了重大的发展。一些例子包括通过电容传感和光谱技术(例如，拉曼光谱和NIR光谱、傅里叶变换红外光谱或FTIR，以及基于衰减全反射的FTIR或ATR-FTIR24光谱)在线监测细胞生物量和细胞培养。尽管在上游细胞培养步骤中整合PAT已经取得了重大进展，但下游工艺在先进PAT实施方面仍然存在一些滞后。目前，将自动样品制备设备，如流动注射分析(FIA)系统与专用在线高效液相色谱相结合，以用于监测多种生物药CQA的趋势正在增长然而，由于缺乏专用的硬件和软件定制，以及缺乏使用基于FIA的PAT进行完全自主药物CQA分析的相关方案开发，这些技术尚未被广泛采用。不过，利用PAT对CQA进行实时监测无疑是未来研究的一个主要方向。
工艺整合
已有文献报道了不同层次的工艺整合，包括: （i）连续上游工艺与中间产物捕获步骤的部分整合；(ii)完整的端到端整合，其中连续的上游单元操作与连续的捕获步骤相连接，随后是批次模式的下游纯化步骤；(iii)端到端封闭式系统，其中工艺流体不暴露于生产环境。一个理想的连续生产工艺必须将所有工艺单元操作与适当的PAT工具以及基于“软”传感器的工艺模型完全整合，以实现基于工艺偏差或干扰的实时自主决策。据我们所知，虽然在文献中没有报告的案例研究，证明一个完全整合的上游和下游工艺的成功实施，并用于生物治疗药物(如mAb)的规模化生产，但目前，一些领先的制药公司可能至少在中试规模上实施了这一措施。
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原文：V.Chopda, A.Gyorgypal, O.Yang, et al., Recent advances in integrated process analytical techniques, modeling, and control strategies to enable continuous biomanufacturing of monoclonal antibodies. J.Chem.Technol.Biotechnol., 2021, DOI10.1002/jctb.6765.
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